Soutenance de thèse de Martino BENVENUTI

Ecole Doctorale
SCIENCES CHIMIQUES - Marseille
Spécialité
Sciences Chimiques
établissement
Aix-Marseille Université
Mots Clés
Biodiversité,Mécanisme,Catalyse,Maturation,Ni-CODH,
Keywords
Biodiversity,Mechanism,Catalysis,Maturation,Ni-CODH,
Titre de thèse
Étude de la biodiversité des CO-déshydrogénases à nickel
Exploring the biodiversity of Ni-dependent CO-dehydrogenases
Date
Friday 20 December 2019 à 13:30
Adresse
31 Chemin Joseph Aiguier, 13400 Marseille
Salle Desnuelles
Jury
Directeur de these M. Christophe LEGER CNRS Laboratoire de Bioenergetique et d'Ingenierie des Protéines (BIP)
CoDirecteur de these M. Sébastien DEMENTIN CNRS Laboratoire de Bioenergetique et d'Ingenierie des Protéines (BIP)
Examinateur Mme Francesca VALETTI Dipartimento di Scienze della Vita e Biologia dei Sistemi, Università di Torino
Rapporteur M. Yvain NICOLET Institute of Structural Biology (IBS)
Rapporteur Mme Béatrice GOLINELLI-PIMPANEAU Laboratoire de Chimie des Processus, Collège de France
Examinateur Mme Jalila SIMAAN Campus Scientifique de St Jérôme

Résumé de la thèse

Les monoxyde de carbone déshydrogénases contenant du nickel (CODH) sont des enzymes qui catalysent le CO/CO2 interconvertion. Celles du type CooS sont homodimériques et comportent cinq centres [FeS] : dont deux centres [4Fe4S] appelés clusters B, impliqués dans le transfert d’électrons, ainsi qu’un cluster C (le site actif), un centre [Ni4Fe4S], et enfin un cluster D pouvant être soit un centre [2Fe2S] soit un [4Fe4S], à l’interface des deux monomères. Pendant mon doctorat, j’ai étudié différents aspects de la réactivité de la CODH de Desulfovibrio vulgaris (Dv) : sa réaction avec l’O2, sa chaîne de transfert électronique et son mécanisme d’activation. J’ai également produit pour la première fois et caractérisé les deux CODHs de l’archaebactérie thermophile Thermococcus sp AM4. Le CODHs sont considérées comme étant très sensibles au dioxygène, et de ce fait leur purification est toujours faite en anaérobiose stricte. Cependant, nous avons observé que la CODH de Dv peut être purifiée en aérobiose et qu’après celle-ci, elle conserve, en grande partie, son activité. Nous avons découvert que cette propriété était due à la nature du cluster D. Le cluster-D exposé à la surface de l’enzyme n’a jamais pu être observé par les méthodes spectroscopiques et son potentiel d’oxydo-réduction semble très bas. Pour la première fois, notre collaborateur, Pr. Pandelia de l’université de Brandeis (US), a réduit le cluster-D avec la dithionite et a pu le détecter par EPR et par la spectroscopie Mössbauer. Nous avons essayé de déterminer le potentiel redox des centres [FeS] de plusieurs variants de la CODH (absence de nickel dans le site actif, délétion du cluster-D ou sa transformation en [4Fe4S]). Pour toutes les protéines, nous avons observé deux transitions redox survenant au même potentiel. De ces résultats, nous en concluons que la chaîne du transfert électronique dans la CODH de Dv est très robuste, que le cluster-D reste oxydé au-dessus de -530 mV vs SHE à pH 8 et qu’enfin le nickel n’affecte pas les potentiels des deux transitions redox. D’autres expériences devront permettre de comprendre quel cluster est réduit pendant le titrage redox suivis par spectrophotométrie UV-vis. Certaines CODHs sont purifiées sous une forme partiellement active, et leur activation requiert un traitement chimique ultérieur. L’activation de la CODH de Dv est unique et demande un traitement de l’enzyme par le NiCl2 et du dithionite de sodium. Durant mon doctorat, nous avons découvert de nouveaux protocoles d’activation pour la CODH de Dv. Ces résultats sont une base solide pour de futures investigations. Les CODHs sont très répandues dans la nature et se retrouvent dans les règnes des bactéries et des archées. Selon la littérature, moins de 1% des CODHs ont été caractérisées jusqu’à présent. Les CODH bactériennes sont les plus étudiées et sont produites par des microorganismes ayant des physiologies différentes et habitant des niches écologiques diverses. Dans l’objectif d’explorer la biodiversité de cette famille enzymatique, nous avons décidé d’étudier les CODHs de l’archée Thermococcus sp AM4 (Tc). Cette souche peut réaliser une croissance carboxydotrophique, hydrogénogénique et sulfidogénique grâce à deux CODHs encodées par deux opérons distincts, chaque opéron contient un gène codant pour une maturase CooC. Nous avons pu produire ces deux CODHs de Tc dans Desulfovibrio fructosovorans (Df), avec ou sans leur CooC. Nous avons démontré que les deux CODHs nécessitent une protéine CooC pour être produites dans une forme active chargée en nickel, de plus ces CooC sont interchangeables. La structure cristalline d’une Tc CooS produite en l’absence de CooC, obtenue par le Pr. Dobbek de l’Université Humboldt à Berlin (DE), appuie cette conclusion. En effet, le nickel est absent du cluster-C de cette protéine. Nous avons caractérisé les deux Tc CODHs avec des approches biochimiques et électrochimiques.

Thesis resume

Ni-containing carbon monoxide dehydrogenases (CODH) are enzymes that catalyze the CO/CO2 conversion. CooS-type CODHs are homodimeric enzymes harboring in total five [FeS] clusters: two [4Fe4S] clusters, called B-clusters, involved in the electron transfer reaction, the C-clusters (the active sites), which are [Ni-4Fe-4S] clusters, and the D-cluster, which can be either a [2Fe2S] or a [4Fe4S] cluster, at the interface between the two monomers. During my PhD, I studied different aspects of the reactivity of the CODH from Desulfovibrio vulgaris (Dv): its reaction with O2, its electron transfer chain and its activation mechanism. I also produced for the first time and characterized the two CODHs from the thermophilic archaeon Thermococcus sp. AM4. CODHs are considered to be extremely O2-sensitive and, indeed, the purifications of these enzymes are performed under strictly anaerobic conditions. However, we observed that Dv CODH can be purified aerobically and it keeps a considerable fraction of its activity after the purification. We discovered that this property is related to the nuclearity of the D-cluster. The surface exposed D-cluster has never been detected by spectroscopic methods and its redox potential seems to be extremely low. For the first time, our collaborator Pr. Pandelia from Brandeis University (US) reduced the D-cluster by dithionite and detected it by EPR and Mӧssbauer spectroscopy. We tried to determine the redox potential of the [FeS] clusters of several variants of Dv CODH (absence of nickel into the active site, deletion of the D-cluster or its transformation into a [4Fe4S] cluster). For all the proteins, we observed two redox transitions and they occur at the same potential. From our result we conclude that the electron transfer chain of Dv CODH is very robust, that the D-cluster is not reduced at potential as low as -530 mV vs SHE at pH 8 and that nickel does not affect the potential of any of the two redox transition. Further experiments have to be done to understand which cluster is reduced during the UV-vis spectroscopy redox titration. Some CODHs are not purified in a fully active form and become fully active only after a chemical treatment whose nature can vary. The activation of Dv CODH is unique and requires the treatment of the enzyme with NiCl2 plus sodium dithionite. During my PhD internship, we found out new protocols to activate Dv CODH. The results are a solid base for future investigations. CODHs are widespread in nature and they are found in the bacterial and archaeal kingdoms of life. According to the literature, less than 1% of CODHs have been characterized so far. Bacterial CODHs are the most studied and they are produced by microorganisms having different metabolisms and living in different environmental niches. In order to explore the biodiversity of this family of enzymes, we decided to study the CODHs from the thermophilic archaeon Thermococcus AM4 (Tc). This strain can perform carboxydotrophic hydrogenogenic and sulfidogenic growth thanks to two different CODHs, which are encoded into two different operons, both containing the gene encoding for the maturation protein CooC. We could produce the two CODHs from Tc in Desulfovibrio fructosovorans (Df), with or without their CooC. We demonstrated that the enzymes need a CooC to be produced in a nickel-loaded and active form, and that the maturases are interchangeable. The X-ray structure of one Tc CODH produced in the absence of CooC, obtained by Pr. Dobbek from Humboldt University of Berlin (DE), reinforces this conclusion. Indeed, nickel is not present in the C-cluster of this protein. We characterized the two Tc CODHs with a biochemical and an electrochemical approach.