Soutenance de thèse de David THIEBAUT

L'anion radicalaire superoxyde (O2•-) est l'espèce chimique qui est à l'origine de la formation de la plupart des espèces réactives de l’oxygène (ERO). Les ERO sont impliqués à la fois dans des processus de signalisation physiologiques et dans des processus pathologiques qui conduisent à des dommages irréversibles des biomolécules. Par conséquent, la détection et la quantification de ce radical sont particulièrement intéressantes. Actuellement, l’utilisation de hydroéthidine (HE), en tant que sonde fluorescente, reste la méthode de référence pour évaluer le niveau de O2•- dans les systèmes biologiques. O2•- réagit avec HE pour donner le 2-hydroxyéthidium (2-OH-E+) en tant que marqueur spécifique; cette réaction est médiée par la formation d'un radical cation intermédiaire HE•+. Cependant, dans les modèles biologiques, HE peut également réagir avec les protéines hémiques ou d'autres espèces biologiques importantes pour donner l'éthidium (E+). Malheureusement, les spectres de fluorescence du 2-OH-E+ et de E+ se recouvrent globalement, ce qui empêche d’estimer le niveau de O2•- directement par fluorescence. L’évaluation du niveau de O2•- nécessite donc une séparation par HPLC pour être fait de manière rigoureuse. Dans la mesure où HE n'a pas été conçu pour détecter O2•-, nous avons envisagé dans ce projet de développer de nouvelles sondes dérivées d’HE afin de mieux comprendre son mécanisme avec O2•-, de limiter son oxydation non-spécifique, de varier sa biodistribution dans les cellules pour une détection ciblée de O2•- et d'améliorer sa capacité à détecter O2•- dans les systèmes biologiques. Ces nouvelles sondes et leurs produits d’oxydation ont été synthétisés et caractérisés par spectroscopie de fluorescence. L'efficacité de certaines sondes à base d'HE nouvellement synthétisées pour piéger O2•- ont été évaluée par HPLC avec le système enzymatique hypoxanthine /xanthine oxydase et dans des cellules intactes MiaPaCa-2 ou RAW 264.7. Des partenaires du projet ont également réalisé des expériences de radiolyse pulsée sur de nouveaux dérivés d’HE synthétisés. Ces expériences ont montré que la durée de vie du radical cation, l’espèce qui piège O2•-, a pu être augmentée pour le TMeHPr+ nouvellement synthétisé par rapport à l’étalon-or.

Superoxide radical anion (O2•- ) is the proximal species at the origin of the formation of most Reactive Oxygen Species (ROS). ROS are involved in both physiological redox signaling processes and pathological processes leading to oxidative damage to biomolecules. Therefore, the detection and the quantification of this radical anion are of major interest. So far, Hydroethidine (HE), use as a fluorogenic probe, is the gold standard to evaluate the O2•– level in biological systems. O2•- reacts with HE to give 2-hydroxyethidium (2-OH-E+) as a specific marker, this reaction is mediated by the formation of a radical cation intermediate HE•+. However, in biological models, HE can also react with heme proteins or other biological relevant species leading to Ethidium (E+). Unfortunately, the fluorescence spectra of 2-OH-E+ and E+ overlap, which limits the measurement of the O2•- level directly by fluorescence. The conventional assay of the O2•- level requires thereby HPLC separation. Since HE was not designed for the superoxide detection, we aim in this project to develop new HE-based probes to understand the mechanism between HE and the superoxide, to limit the non-specific oxidation of the probe, to modulate its site-specific detection and to improve its ability to detect O2•– in biological systems. These new probes and their oxidation products have been synthesized and characterized by fluorescence spectroscopy. The efficiency of some newly synthesized HE-based probes to react with O2•– has been evaluated by HPLC in the cell-free system using hypoxanthine/xanthine oxidase and in intact MiaPaCa-2 or RAW 264.7 cells. Pulse radiolysis of some new synthesized HE-derivatives have also been performed by the partners of the project. Their results show that the lifetime of the radical cation, which traps O2•–, of the newly synthesized TMeHPr+ has been increased compared to the gold standard.