Soutenance de thèse de Alessia MUNZONE

Ce travail est centré sur une nouvelle classe de métalloenzymes à cuivre, les « Lytic Polysaccharide Monooxygenases » (LPMOs). Enzymes ubiquitaires, les LPMO font partie de la machinerie lytique impliquée dans la dégradation des polysaccharides récalcitrants, comme la la cellulose ou la chitine. L'intérêt pour l’étude des LPMOs est en grande partie motivé par leur application pour la production d'énergie alternative (bioéthanol) et de produits à haute valeur ajoutée tels que des biopolymères, ou des molécules pour les cosmétiques ou les produits pharmaceutiques. De plus, les LPMOs ont également attiré l'intérêt de la communauté bio-organique en raison de leur chimie fascinante. L'activité des LPMOs repose en effet sur la présence d'un ion cuivre dans le site actif, dont les propriétés sont modulées par une sphère de coordination très inhabituelle. Le site actif est exposé au solvant et l’ion cuivre(II) mononucléaire est coordonné à la fois par l’azote de la chaîne latérale et par le groupe amine primaire de l’histidine N-terminale (formant un motif appelé «histidine brace»), et par une deuxième chaîne latérale histidine. Cette organisation du site actif permet le clivage oxydatif des liaisons glycosidiques des polysaccharides, en présence de dioxygène ou de peroxyde d'hydrogène et d'un donneur d'électrons. Les objectifs du présent travail ont été poursuivis avec une approche interdisciplinaire, utilisant des outils et des concepts fondamentaux allant de la biologie à la chimie, mais toujours avec un accent particulier sur le rôle joué par l'ion du cuivre. Une partie du travail s'est concentrée sur le rôle d’un résidu alanine de la deuxième sphère de coordination (~ 4 Å de l'ion cuivre) très conservé dans les LPMOs bactériennes. Bien qu’il ait été proposé dans la littérature que ce résidu permet d’orienter la coordination du co-substrat (dioxygène ou peroxyde d'hydrogène) sur l’ion métallique, nous avons mis en évidence que d'autres acides aminés (plus volumineux et / ou chargés) peuvent être trouvés à la place de cette alanine dans certaines LPMO bactériennes. Nous avons en particulier montré que la LPMO de Photorhabdus luminescens (PlAA10) qui possède une isoleucine à la place de cette alanine, conserve une activité sur chitine. Nous avons obtenu des données cristallographiques sur PlAA10 et observé que le résidu Ile n'affecte pas de manière significative la géométrie du site actif. La substitution semble toutefois modifier la surface de liaison au substrat. Sur la base de ce résultat, nous avons généré plusieurs mutants portant des substitutions de la deuxième sphère de coordination et étudié l'effet à la fois sur l'activité et les propriétés physico-chimiques du site actif. Une autre partie du travail est centrée sur la réorientation des LPMOs pour la catalyse d’activités abiologiques. Cette approche a été motivée à la fois par l'accessibilité du site actif au solvant au solvant et par la possibilité de moduler aisément les motifs de coordination et donc les propriétés de l’ion métallique. Des variants ont ainsi été conçus pour générer des sites métalliques originaux. Trois structures cristallines ont été résolues et, fait intéressant, l'un de ces nouveaux motifs s'est avéré capable de lier un ion du Cobalt, confirmant l'adaptabilité du site actif et la possibilité d’envisager différents scénarios catalytiques. La création d'une bibliothèque de variants rationnellement conçue représente la première étape d'un projet à long terme, qui explorera les réactions biocatalytiques abiologiques à base de métaux (transfert de carbène, de nitrène).

This work is centred on a new class of copper containing enzymes, the lytic polysaccharide monooxygenases (LPMOs). Widespread across the tree of life, LPMOs are part of the lytic machinery involved in the breakdown of recalcitrant polysaccharides, such as cellulose and chitin. A big part of the interest on LPMOs is driven by their impact on the production of alternative sustainable energy (e.g. bioethanol) and added value products such as biopolymers and chemicals for cosmetics and pharmaceutical industries. Moreover, LPMOs have also captured the interest of the bioinorganic community due to their fascinating chemistry. LPMOs activity relies on the presence of a copper ion in the active site, whose properties are modulated by a very unusual coordination sphere. The solvent-exposed active site is a unique topology feature among copper-containing oxygenases. The mononuclear copper(II) ion is coordinated by both the side chain nitrogen and the main-chain amino group of the N-terminal histidine (forming a motif known as ‘‘histidine brace’’), and by a second histidine side chain. This active site organization allows the oxidative cleavage of glycosidic bonds in cellulose or chitin, in the presence of dioxygen or hydrogen peroxide and an electron donor. The objectives of the present work have been pursued via an interdisciplinary approach, using tools and fundamental concepts that span from biology to chemistry, but always with a particular focus on the role played by the copper ion. One part of the work focused on the role of a second coordination sphere alanine residue (~ 4 Å from the copper ion) highly conserved in bacterial LPMOs. Although this residue was proposed to orient co-substrate (dioxygen or hydrogen peroxide) binding toward a specific position of the metal active site, we have evidenced that other amino acids (bulkier and/or charged) can be found in place of this alanine in some bacterial LPMOs. We have shown that the LPMO from Photorhabdus luminescens (PlAA10) that harbours an isoleucine in place of this alanine residue, retains a chitin-degrading activity. We have obtained crystallographic data on PlAA10 and observed that Ile residue does not significantly affect the geometry of the copper active site, although it appears to affect the substrate-binding surface. Based on this result, we have generated several mutants bearing second coordination sphere alanine substitutions and studied the effect on both the activity and the physico-chemical properties of the active site. Another part of the work focused on repurposing LPMOs toward the catalysis of abiological activities. The aim was to discover novel activities by engineering LPMOs active site, driven both by the natural arrangement of LPMOs scaffold and the solvent accessibility of the metal ion and by the unique coordination motif suitable to generate a large number of coordination motifs. Variants of the active site were designed to access original metal binding sites. Three crystal structures were solved and, interestingly, one of these new motifs was shown to bind a cobalt ion, confirming the adaptability of the LPMO active site to different catalytic scenarios. The creation of a rationally designed library of variants represents the first step of a long-term project, which will explore abiological metal-based biocatalytic reactions (carbene, nitrene transfer).