Soutenance de thèse de Cyril ASELMEYER

La production d’hydrocarbures bio-sourcés pour les biocarburants et la chimie verte représente un enjeu biotechnologique majeur. La Fatty Acid Photodecarboxylase (FAP) est une enzyme microalgale produisant des hydrocarbures à partir des acides gras libres (FFAs). Cette dernière requiert uniquement de la lumière comme source d’énergie et pourrait être utile pour convertir les huiles en hydrocarbures. La FAP est la troisième photoenzyme découverte et la première à être active dans le métabolisme des lipides, et possède de facto un potentiel biotechnologique important. Dans la mesure où cette enzyme agit sur les lipides, l’objectif principal a été d’étudier son comportement vis-à-vis de différentes interfaces lipide/eau afin de mieux comprendre son fonctionnement et la façon dont elle pourrait réagir dans le cadre d’applications industrielles. Un objectif secondaire a consisté en l’étude de l’impact du regime lumineux sur l’activité et l’endurance de l’enzyme. De la FAP de Chlorella variabilis His-taggée a été produite de manière recombinante chez E.coli, purifiée, et le tag Histidine a été retiré. Des couches monomoléculaires de Langmuir ont été utilisées pour caractériser l’adsorption/l’activité interfaciale de l’enzyme. Des liposomes artificiels enrichis en FFAs ont été préparés avec un extrudeur et controlés par Dynamic Light Scattering (DLS). Des essais enzymatiques in vitro ont été effectués sur ces liposomes avec des la lumière de LED blanches, et les hydrocarbures produits ont été extraits par des solvents organiques et analysés par GC-MS/FID. Pour l’étude des effets du régime lumineux, des essais ont été réalisés avec des LED bleus émettant une lumière pulsée ou continue, et les hydrocarbures ont été quantifiés comme précédemment. Les résultats préliminaires en monocouches de phosphatidylcholine ont montré que la FAP dispose d’une forte capacité d’adsorption aux membranes modèles. De plus, lorsque l’activité de la FAP a été testé sur liposomes enrichis jusqu’à 45% de palmitate (mole/mole), l’activité spécifique a pu être triplée comparée à l’activité sur de l’acide gras en bulk. Ces résultats suggèrent une préférence de la FAP pour les acides gras présents aux interfaces membranaires. Des travaux en cours visent à déterminer la séquence de l’extrémité N-terminale de la FAP native de Chlorella variabilis et à déterminer son rôle dans l’adsorption aux membranes. Bien que les travaux préliminaires sur l’étude de la lumière n’ont pour l’instant démontré aucune influence positive de la lumière pulsée sur l’enzyme, les résultats en lumière continue suggèrent néanmoins que l’activité et la dégradation de l’enzyme sont positivement corrélés à l’intensité lumineuse.

The production of bio-sourced hydrocarbons for biofuels and green chemistry is a major biotechnological challenge. The Fatty Acid Photodecarboxylase (FAP) is a microalgal enzyme which produces hydrocarbons from free fatty acids (FFAs). It only uses light as an energy source and could be useful to convert oils into hydrocarbons. FAP is the third light driven enzyme to be identified and the first one known to act in lipid metabolism. It has thus a strong biotechnological potential. Since this soluble enzyme acts on lipids, our main aim is to study its behavior toward different lipid/water interfaces in order both to better understand how it works in vivo and how it may behave under industrial conditions. A secondary objective has been to study the impact of lighting conditions on the activity and endurance of the enzyme. Recombinant Chlorella FAP was produced in E.coli as a His-tagged protein, purified, and His tag was removed. Langmuir monolayers were used to record the adsorption and/or the interfacial activity of the FAP. Artificial liposomes containing FFAs were prepared with an extruder and controlled by dynamic light scattering. In vitro enzymatic assays on those liposomes were performed under LED white light in small glass vials. Produced hydrocarbons were extracted in organic solvents and analyzed by GC-MS/FID. For the study of light, in vitro assays have been performed using pulsed light as well as continuous light, and the activity has been measured in a similar fashion as previously. First results obtained on a monomolecular film of phosphatidylcholine show that the FAP has a strong ability to bind lipid/water interfaces. Moreover, when FAP activity was tested on large unilamellar vesicles containing up to 45 % FFAs (mole/mole), the specific activity of FAP could be tripled compared to the activity on FFAs in bulk. These results suggest a preference of FAP for FFAs presented as membranous interfaces. On-going work aims at determining the N-terminal sequence of the native mature Chlorella FAP and its potential role in adsorption to membranes. Even though preliminary results on the study of light have demonstrated no positive influence of a pulsed light regime so far, they nevertheless suggest a direct positive correlation between light intensity and activity and enzyme degradation.