Soutenance de thèse de Maxime BIZET

Cette thèse porte sur l’étude de la dynamique de la Cytochrome P450 Réductase (CPR) par marquage de spin couplé à la Résonnance Paramagnétique Electronique (RPE). Le principe de cette technique repose sur le greffage de sondes paramagnétiques, le plus souvent des radicaux nitroxyde, à une (ou plusieurs) position(s) choisie(s) sur la protéine. Dans ce projet, une méthode innovante basée sur l’insertion d’acides aminés non naturels (aann), leur marquage spécifique et le piégeage de sondes radicalaires flaviniques endogènes, a été employée permettant d’outrepasser les limitations du marquage de spin sur les cystéines et l’application de la méthode à la CPR. L’étude de la CPR sauvage dans sa forme soluble a permis de caractériser son comportement physico-chimique dans différents tampons, comme son activité, sa taille mais aussi les propriétés redox des cofacteurs flaviniques endogènes. Ces données obtenues sur la CPR wt soluble ont été essentiels pour l’étude de la dynamique de la CPR contenant un ou deux aann(s). L’insertion d’aann(s) a permis le greffage spécifique d’une sonde nitroxyde permettant la mesure de distance entre un nitroxyde et la flavine sous la forme semi-quinone, FMNH•. La double insertion d’aann a permis la mesure de distance entre deux sondes nitroxydes dans un état redox spécifique de la protéine. Nous avons ainsi pu prouver que l’ouverture et la fermeture de la CPR en modifiant la force ionique ne changeait ni les distances au sein du domaine FMN, ni les distances entre le domaine de connexion et le domaine FAD. Nous avons montré que la force ionique ne modifiait uniquement que la distance entre le domaine FAD et le FMNH•, et que ce phénomène était réversible. De plus, ce changement conformationnel observé, i.e. l’ouverture de la CPR, est plus important que ceux observés dans la structure cristallographique publiée dans le cas d’une CPR chimérique (PDB : 3FJO). Par ailleurs, afin de diversifier les sondes spécifiques des aann en vue d’une application plus large, la nature et la longueur de plusieurs marqueurs ont été testés et comparés. Enfin de premières études sur la CPR membranaire ont été réalisées, notamment l’optimisation des étapes de production et de purification. L’état semiquinone flavinique a également été préparé et caractérisé par RPE.

This thesis focuses on the study of the dynamics of Cytochrome P450 Reductase (CPR) using spin labelling coupled to Electron Paramagnetic Resonance (EPR). The principle of this technique is based on the grafting of paramagnetic probes, usually nitroxide radicals, at one (or more) chosen position(s) on the protein. In this project, an innovative method based on the insertion of non-natural amino acids (aann), their specific labelling and the trapping of endogenous semi-quinone flavin radical was used to overcome the limitations of spin labelling on cysteines and allowing its application to CPR. The study of wild-type CPR in its soluble form enabled us to characterize its physical-chemical behavior in different buffers, including its activity, size, as well as the redox properties of endogenous flavin cofactors. These data obtained on soluble wt CPR were essential for studying the dynamics of CPR containing one or two aann(s). Insertion of a aann enabled specific grafting of a nitroxide probe for distance measurements between a nitroxide and the flavin in its semi-quinone state, FMNH•. Double aann insertion enabled distance measurement between two nitroxide probes for a specific redox state of the protein. We were thus able to prove that opening and closing the CPR by modifying the ionic strength of the medium did not change neither the distances within the FMN domain, nor the distances between the connection domain and the FAD domain. We showed that ionic strength solely altered the distance between the FAD domain and the FMNH•, and that this phenomenon was reversible. Moreover, this trapped conformational change, i.e. opening of the CPR, was larger than those observed for the published crystallographic conformation of a chimeric CPR (PDB: 3FJO). Moreover, in order to diversify the aann-specific probes with the objective of a broader application, the nature and length of several nitroxide markers were tested and compared. Finally, initial studies on membrane CPR were carried out, in particular the production and purification optimization. The semiquinone flavinic state was also prepared and characterized by EPR.